真菌能够引起多种疾病，严重威胁着人类的健康。据统计，住院患者感染真菌的死亡率约为50％，全世界每年因为真菌感染会造成超过150万人死亡。不仅如此，每年因为真菌破坏的食物足以养活6亿人口。杀灭真菌如此之重要，迅速催生了一个每年全球总产值达300亿美元的行业。目前，抗真菌只要依靠抗菌药物和杀菌剂，在杀灭真菌的同时，也提高了其耐药性，因此需要持续开发性能更好的抗菌药物。
真菌一般需要附着在生物表面（如上皮细胞和叶子）和惰性表面（如医疗设备）上繁殖，才能引发感染。因此，防止真菌附着在生物表面也是一种抗真菌方法，但是这方面的研究和应用并不多。这是由于真菌在表面的附着本质上是一个被动过程，我们对真菌与不同表面相互作用的机制了解不多，因此很难设计出防止真菌附着的材料。
成果介绍
基于以上分析，诺丁汉大学Simon V. Avery教授课题组在高通量筛选了281种（甲基）丙烯酸酯聚合物后，发现两种聚合物pAODMBA和pTEGMA可以减少人类病原体白色念珠菌、农作物病原体灰葡萄孢菌的附着，表现出优异的抗真菌性能：在3D打印pAODMBA人工瓣膜表面上真菌的附着力，与标准的有机硅瓣膜相比降低了100%。用TEGMA聚合物溶液处理的叶片储存3天后也没有发现灰葡萄孢菌的感染迹象，即时用水反复冲洗叶片，仍能保持良好的抗真菌性。这是世界上第一个通过高通量筛选聚合物以实现抗真菌附着的高分子材料研究。
图1. 聚合物微阵列筛选抗真菌附着材料。（A）通过yCherry表达或刚果红染色检测的白色念珠菌和灰葡萄孢菌的附着测试过程；（B）代表区域的显微图像，该区域包含聚合物微阵列载玻片上的六个聚合物点，比例尺150 μm；（C）6种聚合物的微阵列AFM高度图像，以及所有阵列聚合物的模量（干）和粗糙度直方图，AODMBA：（R）-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁内酯；TEGMA：三（乙二醇）甲基丙烯酸甲酯；tBCHMA：甲基丙烯酸叔丁基环己酯；（D）灰葡萄孢菌在玻璃上粘附的显微图像（左上）以及具有不同附着特性的三种聚合物微阵列，右上图聚合物斑点直径约为300 μm；（E）在聚合物阵列上真菌的附着结果；（F）灰葡萄孢菌和白色念珠菌对不同聚合物的附着性比较。
为了筛选抗真菌附着材料，研究者以打印微阵列的形式筛选了281种丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯均聚物。他们采用原子力显微镜（AFM）对所有聚合物进行分析发现90％的聚合物薄膜均方根（RMS）粗糙度小于4.0，平均模量为2.8±0.7 GPa。
研究者在这些聚合物上培养了两种真菌：白色念珠菌（yCherry标记）和灰葡萄孢菌（刚果红染色），分别在2 h和6 h后确定材料的真菌附着性能。针对上述两种真菌，研究者发现：3.9和1.1％的聚合物具有很高的真菌附着力（>中位附着值的1000％），2.5和3.9％的聚合物真菌附着力很低（<中值的10％），而且这两种真菌具有不同的表面响应特性。
为了研究这两种真菌在聚合物表面的附着模型，研究者采用机器学习（ML）方法评估了表面化学与每种真菌附着的关系，他们采用分子特征描述符和飞行时间二次离子质谱（ToFSIMS）数据建立模型，采用XGBoost算法进行研究，发现根据描述符建立的模型效果较好，亚甲基腈C-CN和羰基C=O基团对白色念珠菌附着力最弱。最终，研究者筛选出了80种对这两种真菌附着力最低的聚合物，其中27种对两种真菌都有效果。
图2. 在筛选出的抗真菌附着材料上生物膜的形成。（A）在孔板上评估真菌生物膜的步骤；（B）白色念珠菌和灰葡萄孢菌在不同聚合物上形成生物膜的程度；（C）在对灰葡萄孢菌（B. cinerea）抗附着有效的聚合物薄膜上测试了丝状真菌Z.tritici和巴西诺卡菌（A.brasiliensis）生物膜的形成。皮尔逊相关系数的R2和P值分别为0.307和0.014（Z.tritici和B. cinerea），0.558和0.0002（A.brasiliensis和B. cinerea）以及0.354和0.007（Z.tritici和A. brasiliensis）。
研究者继续对筛选出的80种真菌附着力最低的聚合物研究其理化特性和生物学性能，真菌培养时间24 h，这样就可以研究生物膜的附着性能。发现对于白色念珠菌来说，有9种聚合物可以减少95％的生物膜附着；对于灰葡萄孢菌来说，有19种聚合物可以减少95％的生物膜附着；在筛选出的27种对上述两种真菌都有效的聚合物中，有2种聚合物可以减少95％的生物膜附着。研究者在对灰葡萄孢菌有效的19种聚合物上测试了丝状真菌Z.tritici和巴西诺卡菌（A.brasiliensis）生物膜的形成，发现有15种聚合物对这三种丝状真菌中的至少两种有抗附着性能。
图3. 所选材料对真菌的抗附着与生长抑制作用。（A）白色念珠菌的附着和毒性；（B）在指定的培养时间后，从聚合物涂覆和未涂覆的孔中收集上清液CS，并将其添加到3T3细胞培养物中（10或100微升），24小时后测定乳酸脱氢酶（LDH）活性；（C）在聚合物涂覆的96孔板中培养15天的灰葡萄孢菌，比例尺1厘米；（D）24小时后，将含有浸出物的培养基转移至预先附着6小时的灰葡萄孢菌的孔中，在24小时后通过OD600测定其生长情况。
考虑到聚合物成本、化学性质和毒性等因素，研究者选择了9种聚合物：DEGMA和TEGMA（对两种真菌有效）；AODMBA、tBCHMA、tBCHA和iDMA（仅对白色念珠菌有效）；mMAOES、DEGEEA和pEGPhEA（仅对灰葡萄孢菌有效）做进一步研究。发现白色念珠菌的生长不受任何聚合物的抑制，在标准10％或100％上清液的条件下，与未涂覆孔相比，用这些聚合物涂覆孔的上清液对小鼠3T3细胞没有表现出明显毒性。pEGPhEA则会强烈抑制灰葡萄孢菌的生长，这可能是由介质中残留或浸出的有毒物质（如单体或低聚物）引起的。
真菌在AODMBA聚合物上的附着行为
图4. 3D打印AODMBA聚合物对白色念珠菌生物膜形成的抑制。（A）将AODMBA聚合物3D打印成不同的器件：3毫米直径的样片和1.9厘米长的人工瓣膜；（B）样片上生物膜的形成；（C）接种48小时后，在瓣膜上用结晶紫（CV）染色的白色念珠菌生物膜，比例尺0.37厘米；（D）相对于未涂覆的微孔板，白色念珠菌CAF2-yCherry（WT）和耐唑类菌株SCS119299X和J980280在AODMBA上的附着百分比。
br 为了研究真菌在筛选出的聚合物上的附着行为，研究者以AODMBA聚合物为材料，采用3D打印技术制备了2种器件：3毫米直径样片和1.9厘米长的人工瓣膜，研究了白色念珠菌在其上的附着行为，并以PEG575DA材料打印的3D器件作对比。发现与PEG575DA相比，在AODMBA样品上白色念珠菌的附着力降低了100％；在AODMBA瓣膜上真菌的附着力，比标准的有机硅瓣膜低得多，在某些瓣膜上附着力同样降低了100%。这些结果表明AODMBA材料在临床抗真菌性能上有潜在应用价值。
真菌在叶子表面的附着行为
图5. 植物叶子抗真菌感染实验。（A）在灰葡萄孢菌感染（右）和未感染（左）之前，将20％的聚合物溶液喷涂到直径1.5厘米的生菜叶上，每天检查感染情况；（B）感染叶片的百分比；（C）TEGMA涂覆（底部）或未涂覆（顶部）叶片表面的扫描电子显微镜图像（放大1000倍），比例尺20微米；（D）如（A）中所述，在感染前用水或不用水冲洗涂有TEGMA涂层的叶子。
研究者又将筛选出的聚合物应用于防止叶子被真菌感染的研究。发现在未喷涂聚合物的叶片上，2天后出现了明显的真菌感染现象，而用TEGMA处理的叶片在3天后也没有发现灰葡萄孢菌感染迹象，表现出良好的抗真菌感染性能。研究者在涂覆TEGMA后，用水反复冲洗叶片，然后接种真菌，发现3天后叶子仍然没有感染迹象，表明这种聚合物涂层有良好的耐雨水冲刷性能，说明TEGMA聚合物在农业领域有潜在应用。
小结
目前抗真菌普遍采用药物抑制的方法，随着真菌耐药性的提高，抗真菌药物的研发受到巨大挑战，诺丁汉大学Simon V. Avery教授课题组另辟蹊径，在高通量筛选了281种（甲基）丙烯酸酯聚合物后，发现9种聚合物对白色念珠菌和灰葡萄孢菌具有优秀的抗附着效果。研究者以AODMBA为原料采用3D打印技术制备了2种结构：3毫米直径样片和1.9厘米长的人工瓣膜，发现与PEG575DA材料相比，在AODMBA样品上白色念珠菌的附着力降低了100％；在AODMBA瓣膜上真菌的附着力，与标准的有机硅瓣膜相比附着力同样降低了100%。用TEGMA聚合物溶液处理的叶片在储存3天后也没有发现灰葡萄孢菌感染的迹象，用水反复冲洗叶片后仍然表现出优秀的抗真菌感染性能。这一研究成果在临床医学以及农业领域有广泛应用前景。
文章及图片来源：高分子科学前沿